【摘要】  目的：研究IFN-γ+874位点基因多态性在内蒙古地区汉族人群慢性阻塞性肺病(COPD)患者中的频率分布,并分析其与COPD发病的相互关系。方法：采用病例对照研究方法进行相关资料的问卷调查，PCR-SSP法检测IFN-γ+874位点在病例组与对照组中的各种基因型频率与等位基因频率。结果：COPD组IFN-γ+874位点AA、AT、TT基因型的频率分别为82.8 %、17.2 %和0.0%;对照组AA、AT、TT基因型的频率分别为63.4 %、33.3 %、3.1 %;COPD组IFN-γ位点+874位点A、T等位基因频率分别为91.4 %、8.6 %，对照组中为80.3 %、19.7 %;COPD组IFN-γ+874位点AA基因型频率及A等位基因频率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：IFN-γ+874 位点基因多态性与内蒙古地区汉族人群COPD的发病有关。

　　【关键词】 慢性阻塞性肺疾病;干扰素-γ;基因多态性

　　慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive pulmonary disease,COPD)是常见的呼吸系统疾病，以慢性气流阻塞、进行性发展为特征，严重危害人类健康，降低生活质量。发病与环境和遗传因素有关，其病因及发病机制尚未完全阐明。

　　干扰素gamma(IFN-γ)第一内含子区+874位点A/T单核苷酸多态性影响转录及IFN-γ的表达量[1-2]。而IFN-γ+874位点基因多态性是否与COPD发病有关，到目前为止尚未见文献报道。本研究采用病例对照方法分析探讨IFN-γ基因多态性与内蒙古地区COPD患者发病的关系，为深入研究COPD的发病机制提供理论依据。

　　1　材料与方法快速发表论文

　　1.1　研究对象　COPD组64例，按照2003年中华医学会呼吸病学分会COPD诊疗指南[3]综合分析确定，病例由包头医学院第一附属医院、内蒙古医学院第三附属医院、包头市中心医院、鄂尔多斯市中心医院提供。对照组66例为健康体检者，未患呼吸系统相关疾病，由包头医学院第一附属医院检验科提供。COPD组与对照组静脉采血2.0 mL，以枸橼酸钠抗凝，-20 ℃冰箱中保存。研究对象的一般资料见表1。表1　研究对象的一般情况计量资料以x±s表示，FEV1:第一秒用力呼气容积，FVC:用力呼气肺活量

　　1.2　试剂与仪器　试剂购自北京鼎国生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR仪(The Perkin-Elmer Corporation PE480),紫外透射反射分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)，DYCZ-24D型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)。

　　1.3　方法

　　1.3.1　DNA提取　枸橼酸钠抗凝的冻存血，室温放置自然融化后取50 μL到1.5 mL的EP管中，加双蒸水至1 mL，混匀，室温静置15 min后3 000 rmp离心1 min，弃上清留残液;向1.5 mL的EP管中加裂解液60 μL，震荡器上剧烈震荡100 s;沸水煮10 min，流水冷却约50 s，振荡器再次剧烈震荡约100 s;11 500 rmp高速离心4 min，上清液中含有模板DNA。

　　1.3.2　引物　上海生工生物工程公司合成。正向引物P1序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3'，正向引物 P2序列：5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3'，外参正向引物P3序列：5'-GCCTTCCAACCATTCCCTTA- 3'，反向引物p4序列：5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3'。

　　1.3.3　PCR及IFN-γ+874 SNP鉴定　联合聚合酶链反应顺序特异性引物法(PCR-SSP)对IFN-γ的基因进行检测。每个样本设立3个反应管，分别加有特异引物P1、P2、 P3。PCR反应体系：总反应体积为12.5 μL，包括：10×PCR buffer 1.25 μL，4×dNTP 0.25 μL，DNA模板2 μL，Taq DNA聚和酶(2 U/μL)0.5 μL，上下游引物各0.1 μL,灭菌双蒸水加至12.5 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃，2 min;变性94 ℃，25 s;退火60 ℃，35 s;延伸72 ℃，45 s;10个循环后，变性94 ℃，25 s;退火56 ℃，35 s;延伸72 ℃，45 s;20个循环，总延伸72 ℃，5 min。每次检测至少设置2个空白对照，PCR反应产物于1.5 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

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　　1.3.4　统计学处理　采用SPSS 15.0建立数据库，对检测结果进行统计学分析。

　　2　结果

　　2.1　PCR扩增　特异引物P1扩增出的IFN-γ基因AA产物和P2扩增出的IFN-γ基因AT产物均为261 bp,内参引物P4扩增产物为426 bp，每例样本有3管扩增产物，即A、T、外参，见图1。

　　图1　IFN-γ+874位点基因PCR扩增

　　第1、4、8泳道为T;第2、5、9泳道为A;第3、6、10泳道为外参，第7泳道为Marker。样本1为AT杂合子(1、2、3泳道)，样本2为TT纯和子(4、5、6泳道)，样本3为AA纯和子(8、9、10泳道)。

　　2.2　IFN-γ+874基因型频率及等位基因频率的比较　COPD组IFN-γ+874位点AA、AT、TT基因型的频率分别为82.8 %、17.2 %和0.0 %，正常对照组AA、AT、TT基因型的频率分别为63.6 %、33.3 %、3.1 %，COPD组AA基因型频率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=6.073，P=0.013);COPD组IFN-γ+874位点A、T等位基因频率分别为91.4 %、8.6 %，对照组中为80.3 %、19.7 %，COPD组A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(χ2=5.356,P=0.021)。见表2。表2　COPD组与对照组中IFN-γ基因型频率与等位基因频率比较

　　3　讨论

　　COPD发病机制目前仍不清楚，而以细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)、巨噬细胞及中性粒细胞为主的气道壁及肺泡隔的慢性炎症和进行性发展的气道阻塞是COPD发病的两大特点[4-5]。由免疫细胞产生的IFN-γ有可能是连接COPD发病机制中细胞分子生物学和蛋白酶/抗蛋白酶系统失衡的桥梁[6]。

　　IFN-γ为一种低分子量的糖蛋白，是细胞因子的重要组成之一，产生于CD4+TH1和CD8+TC1细胞，可激活中性粒细胞，发生呼吸爆发; 也可激活血管内皮细胞，促进CD4+T细胞与内皮细胞的粘附及血管外渗出，参与人体炎症和免疫反应，是COPD发病过程中的重要细胞因子。IFN-γ的合成为遗传基因所控制，IFN基因位于染色体12q13-q24。位于基因表达调控区序列的基因SNP在疾病的个体差异方面有重要意义。IFN-γ+874 位点正好位于转录因子NF-κB的结合位点，此处出现SNP直接影响与转录因子的结合能力，从而影响IFN-γ的表达[7]，TT为高表达基因型,AA为低表达基型,AT为中等表达基因型。IFN-γ在成年鼠肺中的表达能导致许多方面类似人类COPD损害的表现[8]，由此可以推想，人类IFN-γ基因多态性可能与其COPD的患病风险有关[9]。为明确IFN-γ基因多态性与COPD的发病的关系是否相关，本实验对内蒙古地区COPD患者IFN-γ基因多态性进行检测分析，研究结果显示IFN-γ+874位点AA基因型频率在COPD组高于对照组，A等位基因型频率在COPD组亦高于对照组，差异均有统计学意义，提示IFN-γ+874位点基因多态性与COPD的发病有关，携带AA基因的个体患COPD的危险性增加，其机制可能是由于干扰素-γ主要活性就是参与免疫调节,在体内起双向调节作用：一方面,干扰素-γ可激活NK等细胞,参与炎症反应;另一方面,它能抑制B细胞分泌IgE,抑制超敏反应的发生。携带AA基因的个体干扰素-γ的合成或分泌不足，机体的免疫调节能力降低，炎症与抗炎作用失衡，导致了COPD的发生、发展。然而COPD是一种多因素参与的疾病，其中环境因素和遗传因素均起着重要作用，其作用的具体机制仍有待深入研究。

    参考文献： 

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　　[5]　Jeffery PK.Lymphocytes,chronic bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease[J].Novartis Found Symp,2001,234:149-161.

　　[6]　de Boer WI,Sont JK,van Schadewijk A,et al.Monocyte chemoattractant protein 1,interleukin 8,and chronic airways inflammation in COPD[J].J Pathol,2000,190(5):619-626.

　　[7]　Ronchi MC,Piragino C,Rosi E,et al.Role of sputum differential cell count in detecting airway inflammation in patients with chronic bronchial asthma or COPD[J].Thorax,1996,51(10):1000-1004.

　　[8]　Wang Z,Zheng T,Zhu Z,et al.Interferon gamma induction of pulmonary emphysema in the adult murine lung[J].J Exp Med,2000,192(11):1587-1600.

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　　[9]　鲁晓勇，刘进，沈华浩.慢性阻塞性疾病的细胞因子基因易感性[J].国外医学.呼吸系统分册,2004,24(6):383-387.