【摘要】  目的：观察大鼠大脑皮质γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptors,GABAAR)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律，探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法：65只雄性Wistar大鼠随机分为对照组，脑缺血6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(均为手术组)，假手术组;采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，至规定时间点取大脑组织，行HE染色，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。结果：各手术组GABAAR表达均低于假手术组及对照组，与对照组相比，缺血6 h其表达既有降低，至12 h降至最低。而假手术组与对照组相比无统计学意义。结论：急性脑缺血可引起GABAAR表达下调，致使其对兴奋性氨基酸毒性的抑制作用减弱，这种下调和减弱程度与脑缺血的严重程度相一致，提示GABAAR在缺血性脑损伤中有神经保护作用,可能减缓了缺血性脑血管病的进程，同时GABAAR作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应对抗“兴奋毒性”作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。

　　【关键词】  脑缺血;γ-氨基丁酸A受体;大鼠

 

　　　脑缺血时,由于各类氨基酸大量释放,兴奋性氨基(exicitatoryamino acids,EAA)与抑制性氨基酸(inhibitory amino acids,IAA)间平衡被破坏,是导致神经元急性和迟发性“兴奋性毒性”损伤的关键因素。GABAA受体(GABAAR)作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应,对抗兴奋性氨基酸的兴奋性毒作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。

　　为了研究GABAA受体在脑缺血中的作用机制，我们在MCAO模型基础上，动态研究GABAAR在缺血性脑血管病中表达的变化，期待从分子水平揭示GABAAR在脑缺血中的作用机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物及材料　健康Wistar雄性大鼠65只，体重260～310 g,由内蒙古大学动物试验中心提供。鼠抗兔GABAAR多克隆抗体购于美国麦莎公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒、 PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、中性树胶均购于武汉博士德公司。

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　　1.2　实验方法

　　1.2.1　动物分组　将动物随机分为正常对照组(NC)，脑缺血后6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(手术组，IG)及相对应时间点的假手术对照组(SOC),每组5只,共65只。

　　1.2.2　动物模型制备　采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO)，大鼠用10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于鼠台，碘伏消毒后颈部正中切口，暴露右颈总动脉和颈内、外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线。在颈总动脉近分叉处剪一约0.3 mm小口，将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26 mm,长50 mm)经小口处插入，沿颈内动脉入颅，进线深度由分叉处算约20 mm，稍感阻力时停止，此时已至大脑中动脉起始处，结扎用以固定鱼线的结扎线，剪去多余的栓线，缝合手术切口。假手术组除不插鱼线外，其余步骤同缺血组。

　　1.2.3　组织切片制备　分别在上述规定时间点，给予大鼠10 %水合氯醛0.5 mL腹腔注射麻醉，剪开胸腔经左心室快速输入0.9 %氯化钠注射液，同时剪开右心耳，待血色变淡后快速输入4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定脑组织，待鼠颈及四肢僵硬后停止灌注，快速断头取脑，自额极至枕叶分A、B、C、D、E 5等分，取C等分置于4 ℃ 4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定保存24 h,常规脱水、浸蜡、包埋，制成5 μm厚冠状切片。

　　1.2.4　光镜观察　取各组大鼠脑组织切片，经HE染色后，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。

　　1.2.5　免疫组化法检测　GABAAR采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法染色(SABC法)。如何发表论文

　　1.3　图像分析　采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选出10个单位面积，测量免疫组化染色的阳性细胞数。

　　1.4　统计学分析　采用SPSS 10.0统计软件，各组数据均以均数±标准差(x±s)表示，两组间数据比较采用t检验，并进行方差齐性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　神经细胞病理形态学改变　光镜观察对照组、假手术组神经细胞形态结构正常、核圆淡染、核仁明显，未见组织坏死，见图1;手术组缺血灶内可见血管和神经元周围胶质成分肿胀，神经元呈三角形或杆状，胞核偏位并深染，有的甚至裂解、消失，见图2;脑缺血时间越长，细胞变化越明显，缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶，灶内神经元残存较少甚至缺失。

　　2.2　免疫组化结果　免疫组化阳性细胞信号呈棕黄色，在正常组织内GABAAR主要位于细胞膜和胞浆内，见图3;缺血后大脑皮质内 GABAAR阳性神经元显著减少，有些神经元胞浆内着色亦变淡，见图4。与相应时间点HE染色结果比较，发现GABAAR阳性神经细胞减少以缺血灶及其周围部位最为显著，在一些缺血严重的神经组织内看不到阳性神经元。另外，可见缺血灶内胶质成分呈颗粒状，背景染色较对照组浅。

　　与对照组相比，各时间点假手术对照组神经元阳性细胞数均无明显改变(P>0.05);与假手术组相比较，缺血组神经元阳性细胞数于脑缺血后6 h即有降低，12 h降至最低，故GABAAR表达于脑缺血后6 h即有明显降低(P<0.05),12 h降至最低。见表1。表1　各组GABAAR阳性细胞数的变化

　　3　讨论

　　GABAAR是中枢神经系统内主要的抑制性受体,参与了CNS的许多病理生理过程，但目前的研究并不深入。GABAAR功能障碍与多种神经和精神疾病，如脑缺血、癫痫、焦虑、抑郁、疼痛、老年痴呆等有关[1]。巴比妥类和苯二氮卓类(BZ)等药物作用于GABAAR能发挥其镇静、催眠、抗惊厥等药理作用[2]。

　　目前关于GABAAR在缺血性脑血管病病中的作用尚无定论。有资料报道GABAAR在缺血性脑损伤中表达下调，认为其发挥了保护作用;另一些则报道GABA受体的阻断剂具有部分神经保护作用,这表明抑制性递质受体的活动导致兴奋性毒性[3]。GABA受体是通过与GABA结合来实现中枢抑制作用,GABA可阻断Glu兴奋性毒性，抑制细胞膜去极化和Ca离子内流，具有神经保护作用[4-5]。在以往动物试验中,在卒中急性期应用γ-氨基丁酸类物质可减小卒中灶的体积而起到脑保护作用[6-7]。γ-氨基丁酸也参与了神经元损伤[8],并且与兴奋性氨基酸的兴奋毒性相关。二者比例的失衡可导致细胞功能持久或不可逆的改变。

　　1983年由Sigel等首次提纯并测定GABAAR序列后,目前通过cDNA克隆技术已鉴定了哺乳动物大脑中的18个GABAAR亚基,依据其氨基酸序列的相似程度,将亚基系列分为8个亚基族,分别命名为α1-6、β1-4、γ1-4、ρ1-3、δ、ε、π和θ[9]，其中γ2又有两种异构体,即长型γ2L和短型γ2S,从而构成GABAAR复合物的多样性和生理、药理特性的复杂性[10]。如何发表论文

　　目前的大量研究已表明GABAAR介导的生物效应在脑缺血性损伤的保护作用中起着重大作用。GABAAR是由膜蛋白组成的五聚体，由5个亚单位组成，这些膜蛋白控制GABA门控氯离子通道[11]。GABA作用于GABAAR上GABA位点，使神经细胞膜的氯离子通透性增加，由于细胞外氯离子浓度比细胞内氯离子浓度高，氯离子顺浓度梯度差进入细胞内，细胞内膜电位增大而产生超极化，从而介导了突触后膜抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP)的产生,对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋性毒性”作用具有直接的对抗作用。

　　我们在大鼠MCAO模型的基础上，揭示了脑缺血自然病程中GABAAR的变化过程。伤后不同时间脑切片HE染色对照表明，GABAAR弱阳性神经元多为缺血较重的神经元。提示在缺血性脑血管病的自然病程中，GABAAR参与了缺血性脑损伤的过程。我们的研究表明，正常组与各假手术组无差异，说明单纯的手术操作对GABAAR的表达无明显影响。 GABAAR在脑缺血后逐渐下降，缺血再灌注6 h后开始持续下调，12 h最为显著，这也说明GABAAR在继发性神经元损伤中可能发挥着重要的作用。结合以前的研究结果，即血液和脑脊液中的GABA在缺血性脑血管病中呈先升高后降低的双相变化，在缺血后GABA明显增高，再灌注后降低。Shimada等[11]报道再灌注早期GABA水平的升高可能是一种“保护性”反应，但有不少实验表明这种GABA增加可能导致GABA受体质量改变，引起其抑制效应衰减或兴奋性氨基酸释放，因而这种早期反应性增加仍不能对抗大脑皮质缺血性损伤。我们推测脑缺血时GABAAR数量出现的改变,可能与脑缺血损伤时细胞外液中GABA大量堆积，负反馈调控机体GABAAR表达的缘故,也可能是由于受体内移造成的。此外,尚有研究证实[12],选择性NMDA受体激动剂或拮抗剂也可调节GABAAR功能和亚单位的表达,因而推测脑缺血时细胞外液中高浓度的谷氨酸激动NMDA受体可能也参与GABAAR结构的变化[12]。至于迟发性GABAAR密度和分布的变化,则可能与脑缺血时神经元的降解有关。但目前我们没有足够的证据。若从上述GABAAR的改变机理来看，我们对谷氨酸兴奋性毒性的抑制除了集中在怎样去灭活生成过多的Glu及其生成途径上之外，还应关注在缺血再灌注损伤中GABA受体结构和功能的变化。特别是在目前各种氧自由基清除剂、谷氨酸受体阻滞剂和钙离子拮抗剂尚未取得较好临床疗效的前提下,开发和利用拟GABA类药物以及促进或恢复GABAAR功能的药物,对抗兴奋性氨基酸的兴奋毒性,可望成为一种抗脑缺血性损伤的新途径。

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