【摘要】　目的 观察刺五加（AS）对脑出血（ICH）大鼠脑细胞凋亡及其对凋亡调控蛋白Bcl?2、Bax的影响及对ICH脑组织的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与治疗组。治疗组又分为AS大剂量组和小剂量组。用胶原酶注入大鼠尾状核建立ICH模型。治疗组给予AS干预，在不同时间点处死大鼠，测定血肿周围组织细胞凋亡、 Bcl?2和Bax水平。结果 AS治疗组分别于12 h、1、3、7 d凋亡细胞低于模型组（P<0.01，P<0.05）。AS治疗组Bcl?2水平分别于12 h、1、3、7 d表达高于模型组（P＜0.01，P＜0.05）。Bax于12 h、1、3、7 d时AS治疗组表达低于模型组（P＜0.01，P＜0.05）。结论 AS能明显减少ICH后神经细胞凋亡，升高Bcl?2表达水平，降低Bax表达，保护ICH后神经细胞。

　　【关键词】 脑出血；刺五加；细胞凋亡；Bcl?2；Bax

　　　脑出血（ICH）后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。刺五加（AS）对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实，对于出血性脑血管病，临床上也已广泛应用。AS治疗ICH机制，目前尚不完全清楚。本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl?2、Bax蛋白表达基础上，采用AS干预治疗，探讨AS对其影响及脑保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　健康Wistar大鼠126只，雄性，体重250～300 g，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供；原位末端标记法(TUNEL)试剂盒购于美国Roche公司；Ⅶ型胶原酶（1.5 kU/支）购于美国Sigma公司；兔抗大鼠Bcl?2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司；AS注射液（20 ml/支,批号200703162）由黑龙江完达山制药厂生产。

　　1.2  实验方法

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　　1.2.1  动物模型制作

　　参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法〔1〕，实验大鼠禁饮食12 h之后，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上。局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤，按照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕定位尾状核，前囟为0点，向右旁开3 mm,向前0.2 mm，牙科钻钻透颅骨，钻孔直径0.8 mm，微量注射器针头垂直刺入脑组织，进针5.5 mm（右侧尾状核所在部位）。向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0

　　.5 μl（1 U）胶原酶，留针10 min后缓慢拔出穿刺针，缝合皮肤，予局部消毒。假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。动物苏醒后，放回笼内饲养，正常进食进水，室温37℃左右。

　　1.2.2  大鼠选入标准

　　根据Bederson神经缺损体征评分法〔3〕进行综合等级评分。缺损体征达3级及以上者为制模成功。断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。不符合条件的大鼠弃去，重新补充。

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　　1.2.3  大鼠分组与给药  随机将大鼠分为5组。

　　①正常组：大鼠6只,普通饲养，不作任何处理，饲养1 w后断头取脑制作标本。

　　②假手术组：大鼠30只，普通饲养，术后3 h以2 ml生理盐水腹腔注射，以后每日1次，直到处死为止。

　　③模型组：大鼠30只，制作ICH模型（见上述）术后处理同假手术组。

　　④AS小剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液，6.25 ml/kg体重，加生理盐水至2 ml，每日1次腹腔注射。

　　⑤AS大剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液31.25 ml/kg体重，分2次腹腔注射，二次注射间隔8 h以上，直到处死为止。除正常组外分别在术后6、12 h、1、3、7 d断头取脑制作标本，每个时间点观察6只大鼠。

　　1.2.4  组织取材 怎么发表论文

　　在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠，开胸，左心室插管灌注，右心耳剪开引流。先灌注生理盐水150 ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬，然后快速断头取脑。沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处，可见血肿灶。以穿刺点为中心，冠状面取厚度5 mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4 h，脱水后石蜡包埋。以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片，切片厚度4 μm做苏木素?伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。

　　1.3  检测方法

　　1.3.1  HE染色方法观察组织病理学变化

　　切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后，在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。

　　1.3.2  血肿周围组织细胞凋亡水平  TUNEL染色法检测细胞凋亡。切片经过氧化氢、复合消化液处理，加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，37℃孵育1 h,用链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替人末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。高倍光镜下(400倍)计算凋亡指数(AI),即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野，计算每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比和10个视野的平均凋亡细胞百分数，再计算每个时间点（6张切片）平均凋亡细胞百分数。

　　1.3.3  血肿周围组织Bcl?2与Bax的表达检测

　　采用SP方法，加1∶200兔抗大鼠Bcl?2、Bax一抗，经过二抗处理，链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。Bcl?2与Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。计算每个时间点（6张切片）平均阳性细胞数，方法同前述。

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　　1.4  统计学处理

　　采用SPSS13.0统计学处理软件，数据采用x±s表示。经过方差齐性检验后，组间两两比较采用单因素方差分析。

　　2  结果

　　2.1  病理形态学结果

　　HE染色400倍切片中，可观察到血肿周围部分细胞体积缩小，细胞核浓染，细胞核染色质聚集于细胞核一侧呈新月形，并大小不等的核碎片，见图1。

　　2.2  AS对血肿周围组织细胞凋亡的影响

　　凋亡细胞在TUNEL染色下胞核呈棕褐色。正常组和假手术组仅有少量凋亡细胞，两组比较差异不明显（P＞0.05）；模型组、 AS小剂量组与AS大剂量组，6 h凋亡细胞数即明显高于假手术组，1 d达高峰，之后逐渐下降，但至7 d仍较假手术组显著增高（P＜0.01）；AS小剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12 h减少（P＜0.05），1、3、7 d明显减少（P＜0.01）；AS大剂量组与模型组比较，凋亡细胞数于12 h、1 d、3 d、7 d明显减少（P＜0.01）；AS大剂量组与AS小剂量组相比，凋亡细胞数于1、3 d减少（P＜0.05），7 d明显减少（P＜0.01）。见图1和表1。表1  AS对大鼠ICH后细胞凋亡的影响（略）

　　2.3  AS对血肿周围组织Bcl?2表达的影响

　　Bcl?2阳性细胞SP染色时胞浆呈棕褐色，主要表达于大脑皮质与基底节区。Bcl?2表达水平：假手术组各时间点与正常组对比无显著差异（P＞0.05）；模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时即有表达，12 h时达高峰，之后逐渐下降，7 d仍有相对较高表达。三组之间差异明显。模型组各时间点均明显高于假手术组（P＜0.01）；AS小剂量组12 h表达高于模型组（P＜0.05），1、3、7 d表达明显高于模型组（P＜0.01）；AS大剂量组于12 h、1d时表达较AS小剂量组增高（P＜0.05），3、7 d表达明显高于AS小剂量组（P＜0.01）。见图1和表2。表2  AS对大鼠ICH后Bcl?2的影响（略）

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　　2.4  AS对血肿周围组织Bax表达的影响

　　Bax主要表达于血肿周围区，阳性表达细胞SP染色胞浆呈棕褐色。假手术组与正常组很少表达，两组无显著差异（P＞0.05）；模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6 h时较少表达，12 h时开始增加，1 d达高峰，3 d明显下降，7 d仍有表达，三组间有明显差异。模型组于各时间点均较假手术组明显增加（P＜0.01）；AS小剂量组表达于12 h低于模型组（P＜0.05），1、3、7 d明显低于模型组（P＜0.01）；AS大剂量组于12 h、1 d、3 d低于AS小剂量组（P＜0.05），7 d明显低于AS小剂量组（P＜0.01）。见图1和表3。表3  AS对大鼠ICH后Bax的影响（略）

　　3  讨论

　　细胞凋亡是由多基因调控的细胞程序性死亡过程，是一种基本生命现象，具有维持机体正常生理过程和多细胞生物正常发育成熟的作用。细胞凋亡受到机体的严密调控，其过程是瀑布式基因表达过程，许多基因参与这一过程。其中包括Bcl?2基因家族。该基因家族可分抗凋亡（Bcl?2、Bcl?XL等）和促凋亡（bax、bad、bid等）两大亚族。由Bcl?2基因表达的 Bcl?2蛋白是一种膜合蛋白，包括分子量各为26 kD的Bcl?2α和21 kD的Bcl?2β两种相似蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜等处，主要功能是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。作用机制与抑制氧自由基产生、抑制 Ca2+释放、阻止半胱氨酸蛋白酶?3（Caspase?3）激活、抑制Bax蛋白的促凋亡作用以及抑制细胞色素C释放等方面有关。Bax蛋白是 Bcl?2的同源蛋白，同样存在于线粒体外膜、内质网膜和核被膜的细胞质面，能够增加线粒体膜通透性，使细胞色素C释放至细胞质并与衔接蛋白即凋亡蛋白激活因子（Apaf?1）结合，促进Caspase级联反应，导致细胞死亡。Bax还通过与Bcl?2蛋白结合形成异二聚体，使Bcl?2失去抑制细胞凋亡的作用。正常细胞中，存在Bax与Bcl?2微量表达，细胞是否发生凋亡，依赖于Bcl?2/Bax的比例〔4〕。

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　　研究〔5〕表明,细胞凋亡是ICH后脑组织损伤的主要原因。ICH后神经细胞死亡分为坏死和凋亡。坏死以神经细胞肿胀和溶解为特征,包括群体细胞死亡和继发炎症反应。凋亡则以细胞核皱缩形成凋亡小体为特征。血肿压迫、血肿局部血流量下降、自由基大量产生、炎症反应〔6〕、凝血酶〔7〕及血液成分如血红蛋白等因素均可诱发或加重细胞凋亡。细胞凋亡可以被外界因素如药物、低温等中止，因而抑制细胞凋亡可促进神经功能恢复。本实验通过应用AS干预大鼠 ICH模型，观察其对ICH后凋亡细胞的影响。

　　AS注射液是一种中药制剂，系AS茎叶精制而成的无菌水溶液。主要化学成分为异嗪皮定、β?谷甾醇、异秦皮定甙、紫丁香树酯醇甙等。根据祖国医学，AS具有补肾安神、益气固本、活血通络、强身延年之功效。近年来临床应用AS注射液治疗ICH 取得明显效果〔8〕，但其治疗机制仍待深入探讨。本实验显示,细胞凋亡伴随ICH而大量产生。但治疗组12 h、1、3、7 d凋亡细胞数明显低于模型组，且大剂量组疗效明显优于小剂量组。表明AS可明显对抗ICH神经细胞凋亡。其机制可能为：①AS具有清除氧自由基，升高超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低过氧化脂质LPO）作用〔9〕；②扩张脑血管，增加血肿周围局部血流量〔10〕。可减轻脑水肿，改善微循环，降低血黏度，抑制血小板聚集；③具有抗炎作用〔11，12〕，抑制炎症因子对血肿周围组织的损伤。减少炎症因子产生，从而降低了某些炎症因子参与的细胞凋亡过程。

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　　Bax于ICH后6 h即有表达，1 d达高峰，表明Bax表达高峰期与细胞凋亡一致，显示其与细胞凋亡一致性。Bcl?2在ICH后12 h达高峰，表达高峰较Bax提前，此可能与ICH损伤诱发细胞的保护机制激活有关。ICH时,血肿的占位导致血肿周围组织血流量下降,局部缺血缺氧,产生大量自由基和其他细胞因子〔13〕，诱发细胞凋亡。AS通过Bcl?2表达升高阻止以上因素所诱导的细胞凋亡,发挥抗凋亡作用。ICH后细胞凋亡和 Bcl?2、Bax的表达均呈现规律性的变化，从6 h至7 d，ICH后Bcl?2与Bax表达均明显高于正常组与对照组，显示在细胞凋亡调控过程中，各种因子之间的相互拮抗作用。AS干预后于12 h、1、3、7 d可明显提高Bcl?2表达，于12 h、1、3 d可降低Bax表达，大剂量组尤为明显。提示AS可能通过升高Bcl?2表达，降低Bax表达而抑制细胞凋亡，从而发挥脑保护作用。

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　　9 Lee YJ,Chung HY,Kwak HK,et al.The effects of A.senticosus supplementation on serum lipid profiles，biomarkers of oxidative stress，and lymphocyte DNA damage in postmenopausal women〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008；375(1)：44?8.

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