【摘要】 目的：探讨槲寄生生物碱对肝癌细胞株SMMC?7721 P53基因表达的影响。方法：MTT法测定槲寄生生物碱对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的抑制作用；半定量RT-PCR法测定抑癌基因P53 mRNA表达变化。结果：槲寄生生物碱作用后SMMC-7721细胞出现显著生长抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。RT-PCR检测SMMC-7721细胞中P53 mRNA表达的相对强度，发现0.100mg/mL的槲寄生生物碱作用于SMMC-7721细胞24小时后，P53 mRNA表达的相对强度增高(P＜0.01)。结论：槲寄生生物碱对抑癌基因P53表达的影响可能是其抑制肿瘤生长的分子基础。

　　【关键词】  槲寄生生物碱；P53；RT-PCR；人肝癌细胞株SMMC-7721

　　　　原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤的第二位[1]，且原发性肝癌具有起病隐匿、进展迅速、高度恶性、易转移复发、治疗难度大、生存期短等特点，被称为“癌中之王”[2]。目前肝癌以外科手术为首选治疗方案，但术后5年生存率并不理想，总体只有62.9%，大肝癌术后5年生存率仅34.6%。近年来应用传统的中药治疗日益受到重视。槲寄生为桑寄生科植物槲寄生［Viscum coloratum(Komar)Nakai］的干燥带叶茎枝，其味苦、平，归肝、肾经，有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎作用[3] ，且槲寄生有较好的抗肿瘤效果[4] 。本文从分子水平探讨槲寄生抑制肝癌的机制。

　　1  材料与方法

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　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞株  人肝癌细胞SMMC-7721，购于中国科学院上海细胞研究所。

　　1.1.2  主要试剂和仪器  RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青公司)，二甲基亚砜、MTT(Amersco)，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒（宝生物公司），琼脂糖（Promega），引物（上海生工）、Forma CO2培养箱（美国），ELX-800酶标仪（美国），Enpddorf低温离心机（德国），PCR仪(美国)，紫外分光光度计（日立），倒置显微镜、凝胶成像系统（上海康乐）。

　　1.1.3  药物  槲寄生购于包头益仁堂中药房，山西医科大学药学系扬官娥教授鉴定该中药为槲寄生并非其他寄生。槲寄生生物碱由本校化学教研室予以提取。将提取物以碘-碘化钾试剂、碘化汞钾试剂检验呈阳性反应，证明提取物为槲寄生生物碱。

　　1.2  方法

　　1.2.1  体外细胞培养  细胞培养于含10%胎牛血清、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养基中, 37℃、5%CO2培养箱中培养,每2天换液1次。

　　1.2.2  MTT法测定槲寄生生物碱对肝癌细胞增殖的影响  取对数生长期的肝癌细胞调整至1×105/mL，取0.200mL接种于96孔板，置37 ℃、5%CO2培养24h后弃原培养液,加入浓度为0.200mg/mL、0.100mg/mL、0.050mg/mL、0.025mg/mL槲寄生碱培养液各0.200mL，每个浓度设6个复孔，分5次重复，并设阴性对照、5-Fu阳性对照（10μg/mL）和空白对照孔，同时作3个板。分别作用 24h、48h、72h后倾去上清液,用D-Hanks洗涤2次，各孔加入5%MTT 0.020mL，37℃4h后吸去上清液,加入DMSO 0.150mL,振荡10min使结晶充分溶解后上酶标仪490nm处测吸光度A值。抑制率(%)=(对照孔A值-实验组A值)/对照孔A值×100 %。依据MTT结果用改良寇氏法计算IC50。

　　1.2.3  槲寄生生物碱对人肝癌细胞SMMC-7721P53 mRNA表达影响的测定  （1）细胞给药：取对数生长期的SMMC- 7721细胞调整至2×105/ mL,2.500mL接种于6孔板,置37℃、5 %CO2培养箱，培养24h后弃原培养液,对照组加入不含药物的培养基2.500mL，试验组依据MTT结果加入含浓度为0.100mg/mL槲寄生生物碱培养液2.500mL培养24h(抑制率为38%)。（2）总RNA的提取：用RNAiso Reagent提取试剂,经氯仿抽提、异丙醇沉淀，分别提取实验组和对照组细胞总RNA。提取的总RNA用紫外分光光度计在260nm和280nm下检测其吸光度值，以A260nm/A280nm比值表示其纯度。（3）引物设计：参考文献[5-6] 及GenBank中基因序列设计引物。P53上游引物：5′-TGTCCCCGGACGATATTGAAC-3′，下游引物：5′ -TTCCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。（4）RT-PCR反应：逆转录取总RNA 1μL按反转录试剂盒要求配成10μL反应体系，实验组和对照组分别进行逆转录PCR反应。转录条件为30℃ 10min、50℃ 20min、99℃ 5min、5℃ 5min，共一个循环。（5）PCR反应：β-actin扩增条件: 94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环,72℃延伸8min。P53扩增条件：94℃预变性2min，94℃30s，56℃30s,72℃1min,35个循环,72℃延伸8min。

　　1.2.4  半定量分析  将扩增的RT-PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳45min。电泳结束后在紫外透射仪下观察电泳条带,于凝胶成相仪上进行目的条带的密度定量,以目的基因条带的密度与内参β- actin的密度之比作为该目的基因的mRNA的相对含量。

　　1.2.5  统计学处理  实验结果用SPSS 11.5统计分析软件处理，数据用x±s表示，行t检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2  结果在哪发表论文

　　2.1  槲寄生生物碱对细胞增殖的影响  槲寄生生物碱对SMMC-7721细胞有显著生长抑制作用，且呈剂量和时间依赖方式，0.100mg/mL和0.200mg/mL浓度组在24h、 48h、72h均表现出抑制SMMC-7721细胞生长作用，抑制率分别为38%、52%、75%和52%、74%、93%，且作用强于5-Fu。 0.050mg/mL组及0.025mg/mL组也表现出抑制SMMC-7721细胞生长作用，在3个时间点抑制率分别为9%、21%、49%和0%、5 %、23%，但作用弱于5-Fu。

　　2.2  RT-PCR结果

　　2.2.1  总RNA抽提结果  所提取RNA经紫外分光光度计检测A260nm/A280nm比值为1.8，说明提取的样品为较纯的RNA。

　　2.2.2  槲寄生生物碱对人肝癌细胞SMMC-7721 P53 mRNA表达的影响  0.100mg/mL槲寄生生物碱作用24h后能增强人肝癌细胞SMMC-7721 P53 mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。电泳及P53 mRNA/β-actin mRNA半定量见图1及表1。

　　图1  槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞P53 mRNA表达的影响（略）

　　M为Marker，1、3为对照组，2、4为药物组，1、2为P53，3、4为β-actin内对照

　　表1  槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞P53 mRNA表达的影响（略）

　　*与对照组比较P<0.01

　　3  讨论在哪发表论文

　　槲寄生是我国传统中药，分布广泛，在我国主要分布在东北、华北地区，资源丰富。为了开发利用天然资源，国内外的学者作了大量的工作。目前证实槲寄生有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用。目前研究较多的是槲寄生苷类的结构及槲寄生毒肽的抗肿瘤作用，对生物碱的研究不多。彭海燕等[7]的研究表明槲寄生生物碱在120mg/kg计量时对小鼠肝癌H22 的抑瘤率可达73.8%。肿瘤抑制基因是肿瘤遗传学及分子生物学的研究热点。P53基因与肿瘤关系最为密切。野生型的P53基因产物监控基因组的完整性，当DNA受到损伤时，野生型P53产物通过转译后的稳定作用，蓄积、促进细胞周期停留在G1期，用这额外的时间进行修复[8]。野生型P53基因的结构和表达异常是肝癌中最多的基因改变之一[9]。

　　本实验从分子水平探讨槲寄生生物碱的作用机理与基因表达的关系。我们选择了与肿瘤发生关系密切的基因P53作为研究对象，检测其mRNA的表达。研究发现，槲寄生生物碱0.100mg/mL作用于肝癌细胞株SMMC-7721 24h后，野生型P53表达增强。这表明槲寄生生物碱可能激活抑癌基因P53而使癌细胞死亡从而发挥其抗肿瘤作用。对于槲寄生生物碱作用后其他浓度及时间点基因表达的改变有待继续研究。

　　参考文献： 

    [1] 中华人民共和国卫生部.1995中国卫生统计提要[C].中华人民共和国卫生部，1995：73.

　　[2] 张健，赵秀丽，翟玉萍.原发性肝癌中医药治疗进展[J].内蒙古中医药，2004,（6）:35-36.

　　[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:化学工业出版社，2005:258.

　　[4] 王庆瑞,刘梅筠,王东阳，等.槲寄生总生物碱的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志.1994,19(1):45-47.

　　[5] Khan ZA,Jonas SK,Le-Marer N,et al.P53 mutations in primary and metastatic tumors and circulating tumor cells from colorectal carcinoma patients[J].Clin Cancer Res,2000,6(9):3499-3504.

　　[6] Selvakumaran M,Lin HK,Miyashita T,et al.Immediate early upregulation of Bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways[J]. Oncogene，1994，9:1791-1798.

　　[7] 彭海燕,章永红,韩英,等.槲寄生碱抗肝癌作用试验性研究[J].实用中医药杂志，2004， 20(5):227-228.

　　[8] Vaziri H,Benchimol S.From telomere loss to p53 induction and activation of a DNA-damage pathway at senescence: the telomere loss/DNA damage model of cell aging[J].Exp Gerontol,1996,31(1-2) :295-301.

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　　[9] Bressac B,Galvin KM,Liang TJ,et al. Abnormal structure and expression of p53 gene in human hepatocellular carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(5):1973-1977