【摘要】目的：研究实验性视网膜脱离(retinal detachment,RD)及脱离复位后神经感觉层细胞凋亡情况，探讨RD后视功能损害的机制为临床治疗提供理论基础。方法：健康成年无眼部疾病青紫兰兔40只，采用计算机随机数字表法分为RD后1, 3h;1, 3, 7, 14, 28d组及正常对照组，共8组，每组5只，选取右眼为致伤眼，视网膜下注射透明质酸钠建立RD模型；分别于建立模型后按时获取兔眼标本，以TUNEL法观察视网膜神经感觉层细胞的凋亡情况。结果：视网膜脱离复位后存在着神经感觉层细胞凋亡现象，正常对照组、14d和28d组几乎不见凋亡细胞，脱离后 1,3h;3, 7d组在视网膜各细胞层均出现较多的、具有凋亡形态学与生化改变特征的凋亡细胞，其中在3d组视网膜感觉层细胞凋亡细胞数量达到高峰。视网膜神经感觉层凋亡细胞数目在1,3h; 3, 7d 组之间两两比较均有显著性差异（P<0.01）；1,3h; 3, 7d 组与正常对照组、1h;1, 28d组之间两两比较均有显著性差异（P<0.01）；正常对照组、1h; 14, 28d组之间两两比较无显著性差异。结论：RD复位后，神经感觉层细胞发生凋亡。

     【关键词】视网膜脱离；神经感觉层；细胞凋亡；视网膜

　　0　引言

　　视网膜脱离(retinal detachment, RD)是临床常见的致盲性眼病。随着基础研究的深入和临床手术器械及技术的发展，RD 术后解剖复位率得到较大提高，但视功能恢复仍不理想。近年来研究发现RD后出现光感受器损伤、视网膜内外层变性坏死，常伴有不同程度的细胞凋亡，同时视功能的损害与P53, bcl?2等基因有不同程度的相关性[1,2]。我们建立RD动物模型，在RD组织进行电镜和TUNEL染色观察，旨在探讨RD的发病机制，为临床治疗探寻新的思路。

　　1　材料和方法学术论文发表

　　1.1　材料

　　成年健康无眼部疾病青紫兰兔40只,福建医科大学动物中心提供,体质量2～3kg，雄雌兼用，外眼及眼底检查正常，计算机随机数字表法进行分组，分为RD后1,3h;1,3,7,14,28d组及正常对照组，共8组，每组5只。

　　1.2　方法

　　按以往报道的方法建立RD模型[3,4]。选取右眼为实验眼，以5g/L托吡卡胺（日本参天制药株式会社）散瞳，采用30g/L戊巴比妥纳 1mL/kg兔耳缘静脉麻醉。在角膜缘处进行前房穿刺降低眼压，颞下方角巩缘后2.0mm处，20G巩膜穿刺刀刺穿巩膜。于角膜表面置前置镜，显微镜下，伸入27G前房注射针(美国Beaver公司)，在视盘颞侧3PD处视网膜上造孔（裂孔约1/2PD），然后向视网膜下缓慢推注1g/L透明质酸钠 0.2mL(上海建华精细生物制品有限公司)，可见整个后极部视网膜呈境界清楚的灰白色隆起，范围约10PD，直到赤道前。所有造模由同一操作者序贯完成。术后观察均有RD。裂孔闭合较快,3d后已只隐约可见,7d后全部RD模型裂孔已不可见；RD能维持9～12 (平均10.2)d，14d后所有眼视网膜在眼底镜下观察及B超检查均已复位。实验兔均在同一条件、不同时间点进行眼部伤情观察，眼底检查是在用散瞳剂充分散瞳后用直接检眼镜对包括周边部在内的眼底结构进行细致的检查。眼部检查由同一名高年资眼科医师完成。严格按照德国Roche Molecular Biochemicals公司TUNEL染色检测方法操作。以细胞核染色呈棕黄色为阳性标志，同时符合凋亡细胞形态（核固缩或核质碎裂贴边,出现核周空泡）才能判定为凋亡染色阳性细胞。细胞计数采用在高倍镜下(×400)使用0.5网形目镜尺(5mm×5mm,各分为10等分，上海第三光学仪器厂)分别计数2.5mm2视网膜面积里的凋亡阳性细胞数。双目检验镜下（×400倍）对神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)、内核层(inner nucler layer,INL)和外核层(outer nuclear layer,ONL)的阳性细胞计数。各个包埋块取两张切片，每张切片于对称部位（距视盘1.33mm处左右两侧）各取一个视野进行观测，4个测量值相加取平均值作为每眼的最终观察值。透射电镜标本制备：常规经由兔耳缘静脉空气栓塞处死动物，摘取兔眼球后，在垫有冰液的平皿上，沿赤道部剖开眼球，迅速去除角膜、晶状体及玻璃体，置体积分数2.5g/L的戊二醛磷酸缓冲液中4℃下固定3～4h,将眼杯后极部视盘颞侧组织切成1mm×3mm的条块，放入 pH7.2的磷酸缓冲液中4℃以下浸洗后，10g/L锇酸固定40min，巴比妥缓冲液浸洗，梯度乙醇、丙酮脱水，无水乙醇与环氧树脂浸透、包埋，半薄切片定位。定位后将标本修成块状，超薄切片机将标本切成40～60μm厚的薄片，铜网捞片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，电子显微镜观察并拍照。电子显微镜由专业技术人员操作。

　　统计学分析:对数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理，首先进行方差齐性检验，符合正态分布采用方差分析中均数的两两比较进行分析，计量数据用±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果学术论文发表

　　2.1　透射电镜观察

　　正常组兔眼内界膜(inner limiting membrane, ILM)为一电子密度均匀、染色一致的结构；神经纤维层（nerve fiber layer，NFL）微管及线粒体清晰可见；视网膜神经节细胞(retinal  ganglion cell, RGC)核较大，核仁、线粒体、内质网及核蛋白体清晰可见，线粒体呈圆形或长梭形，可见大量游离核糖体及微管；内核层中双极细胞呈圆形或椭圆形，胞异质内可见线粒体等细胞器；外核层排列紧密，染色质分布均匀；外节盘膜密集呈板层状排列，整齐有序，与视网膜色素上皮层(retinal pigment epithelium, RPE）顶端微绒毛相嵌排列。RD后1h组 NFL线粒体肿胀，嵴变短甚至消失，微管减少或消失；GC计数减少，核浓缩，电子密度加深且不均匀，线粒体、内质网肿胀，线粒体嵴消失；ONL细胞核浓缩，核膜电子密度加深且不均匀，感光细胞外节盘膜排列紊乱并有局限性断裂、脱离。RD后3h组 RGC和INL细胞线粒体仍肿胀，嵴模糊不清，核染色质浓缩，体积缩小，密度增加，核膜厚薄不均。RD后1d组 RGC和INL细胞核体积缩小，可见凋亡小体，表明存在凋亡现象。RD后3d组 RGC和INL细胞核体积缩小，核碎裂，凋亡小体多见，外核层亦可见到凋亡小体的存在。RD后7d组 RGC和INL细胞核体积基本正常，局部仍可见胞核浓缩、核膜电子密度不均匀。RD后14d和28d组 RGC和INL,ONL结构正常，核仁清晰可见、细胞器丰富，线粒体结构清楚，染色质分布均匀。

　　2.2　TUNEL结果

　　正常组凋亡细胞0.60±0.843；RD后1h组0.70±0.82；3h组9.00±1.33；1d组15.60±1.43；3d组 26.10±1.79；7d组2.90±1.79；14d组0.80±0.92；28d组0.71±0.83。正常对照组视网膜神经感觉层各细胞层（GCL, INL及ONL）几乎不可见TUNEL阳性细胞；RD后1,3h;3d组在视网膜神经感觉层各细胞层均可见TUNEL染色阳性的凋亡细胞，呈均匀淡染的棕黄色；其中3h组TUNEL阳性细胞散在分布，以INL居多;1,3 d组视网膜神经感觉层TUNEL阳性细胞数目明显增多，并以GCL及INL为最多，3d时达到高峰;7d组TUNEL阳性细胞数目明显减少，有的片子上甚至几乎不可见。正常对照组、14d和28d组无TUNEL阳性细胞。视网膜脱离后1,3h;3,7d组之间两两比较均有显著性差异（P<0.01），1,3h;3d组及7d 组与正常对照组、1h;1,28d组之间两两比较均有显著性差异（P<0.01）；正常对照组、1h;14,28d组之间两两比较，无显著性差异。

　　3　讨论

　　细胞凋亡通常表现为核固缩呈新月形，细胞体积缩小，细胞膜皱缩，无核膜破裂，细胞质浓缩，细胞核和细胞质被结构完整的细胞膜包绕分割成许多凋亡小体，不发生炎症反应，是单一细胞发生死亡的行为；凋亡小体的多种细胞器如内质网、溶酶体、线粒体结构多保持完整；其重要的生化特征是DNA片断化。常用检测细胞凋亡的方法有形态学辨认、DNA琼脂糖电泳、DNA片断切口末端标记法及流式细胞仪等。本实验模型制作方法相对简单，可在RD时及RD复位后这一连续病理过程中进行观察，运用光镜、透射电镜和原位缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡，具有相当的准确性。

　　学术论文发表

　　我们采用视网膜下直接注射透明质酸钠的方法建立RD模型，比较符合人眼RD的发病过程 [5,6]。透明质酸钠吸收后视网膜可以自行复位，这样可以连续观察、研究RD发生时和复位后的视网膜的病理过程。我们观察到RD后3h视网膜外核层即出现大量阳性细胞，一直持续到7d时，其中在3d组视网膜神经细胞感觉层凋亡细胞数量达到高峰，与以往研究结果一致[7?10]。我们发现，内核层7d时存在大量阳性细胞，14d视网膜复位早期仍可见到少量阳性细胞，说明RD对光感受器细胞影响较大，这与文献报道的RD中的凋亡表现类似[11]。凋亡细胞在RD视网膜的持续存在，并且逐渐由外核层向内核层发展，提示凋亡在RD的发病机制中发挥了非常重要的作用。以往研究表明[7,12]，RD复位后视网膜细胞发生凋亡不仅导致光感受器细胞丧失，而且以双极细胞为主的内核层和神经节细胞发生的凋亡将导致视信息在二级和三级传导通路上发生传导障碍，影响视网膜功能的恢复。本实验对复位的视网膜进行研究，发现复位的视网膜细胞亦有凋亡发生，凋亡细胞主要分布在内外核层和神经节细胞层，随着视网膜复位以及复位时间的延长，凋亡细胞数逐渐减少，表明复位后的视网膜细胞发生凋亡可能同样影响了视网膜功能的恢复。有研究发现[11]，快速视网膜复位(1h和1d)能减少RD所致细胞凋亡。结合RD组织病理学的观察结果可以得出：为减少对视网膜的永久损害，RD治疗时机的选择非常重要，为了阻止视网膜损伤进一步发展，RD后应尽早使其复位，手术干预措施最好在RD 7d内实施，达到抑制细胞凋亡、挽救视网膜神经细胞，从而促进视网膜功能恢复。

 

 

 

　　参考文献： 

  　1　Takita H, Yoneya S, Gehlbach PL, et al. Retinal neuroprotection against ischemic injury mediated by intraocular gene transfer of pigment epithelium?derived factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(10):4497?4504

　　2　C?line C, Cecconi F, Desseni P, et al. Apoptosis?inducing factor (AIF): key to the conserved caspase?independent pathways of cell death. Cell Sci 2002;115(24):4727?4734

　　3　Linberg KA, Sakai T, Lewis GP, et al. Experimental retinal detachment in the cone?dominant ground squirrel retina:morphology and basic immunocytochemistry. Vis Neurosci 2002;19(5):603?619

　　4　Hisatomi T, Sakamoto T, Murata T. Relocalization of apoptosis?1 inducing factor in photoreceptor apoptosis induced by retinal detachment

　　in vivo. Am J Pathol 2001;158(4):1271?1278

　　5　Zacks DN, Zheng QD, Han Y, et al. FAS?mediated apoptosis and its relation to intrinsic pathway activation in an experimental model of retinal detachment. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004;45(12):4563?4569

　　6　Hisatomi T, Sakamoto T,Goto Y, et al. Critical role of photoreceptor apoptosis in functional damage after retinal detachment. Curr Eye Res 2002;24(3):161?172

　　7　Guerin CJ, Lewis GP, Fisher SK, et al. Cone photorecepter recovery after experimental detachment and reattachment: an immunocytochemical, morphological and electrophysiological study. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(1):416?425

　　8　Yang L, Bula D, Arroyo JG, et al. Preventing retinal detachment associated photoreceptor cell loss in Bax?deficient mice. Invest Ophthalmol

　　Vis Sci 2004; 45(2):648?654

　　9　王志玉,付群,史爱云.视网膜挫伤后神经感觉层细胞凋亡的实验研究.眼科新进展2008;8(8):590?594

　　10　王志玉,史爱云.视网膜挫伤兔模型的病理学观察.国际眼科杂志2009;9(8):1469?1471

　　11　Lewis GP, Charteris DG, Sethi CS, et al. The ability of rapid retinal reattachment to stop or reverse the cellular and molecular events initiated by detachment. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43(7): 2412?2420

　　12　孙晓东,张哲,许迅,等.实验性视网膜脱离时神经生长因子对视网膜的保护作用.中华眼科杂志2003;39(5): 303?307